משנת 324 לספירה מאופיינת התקופה בהתבססות איטית אך עקבית של הנצרות באזור אל מול ירידת כוחה של הפאגניות, מאבק תרבות שסימניו ניכרים גם בסקיתופוליס. יחד עם זאת ועל אף ניצחונה של הראשונה הרי שורשי מסורתה ותרבותה של אחרונה עדין ניכרים בעיר במהלך המאה הו' לספירה ובתוואי נופה העירוני אין היא שונה בהרבה מן העיר הרומית המפוארת. השפעות משמעותיות לעיצובה של העיר הביזנטית, מלבד תוצאות השינוי הדתי-תרבותי, יש לראות תחילה ברעש האדמה הפוקד את הארץ בשנת 363 לספירה ותוצאותיו הניכרות בעיר מביאות לשיפוץ חלקים שונים של מרכזה הציבורי. שנים לא רבות לאחר מכן סביב שנת 389 לספירה נערכת חלוקה מנהלתית מחודשת של פלסטינה לשלוש פרובינקיות וסקיתופוליס נבחרת כבירת הפרובינקיה פלסטינה השניה (Palestina Secunda). תחומי הפרובינקיה כללו את שטחי עמק יזרעאל, הגליל התחתון וממזרח לירדן את צפון הגלעד והגולן. העיר הופכת למרכז מנהלתי, מסחרי וכלכלי ומושל הפרובינקיה (archon) היושב בסקיתופוליס מפנה כספי מסים של הפרובינקיה ובירתה לבנייה בעיר. מפרק זמן זה נמצאו כתובות בנייה רבות המציינות מספר רב של מושלי הפרובינקיה שבימיהם שופצו מבני ציבור שונים בעיר כרחובות וסטווים, רחבות ומונומנטים, בתי מרחץ, התיאטרון, האמפיתיאטרון והאודאון, מערכות מים, חומות העיר ועוד.

התקופה הביזנטית נודעה כתקופת שיא בהתיישבות העירונית וגידול האוכלוסין המוצא בעיר את ביטויו בהרחבת השטח הבנוי ואכלוס פרברים חדשים בשולי העיר וכאלה שהוקמו מחוץ לחומה כבתל נהרון, ממערב לעיר וממזרחה. סקיתופוליס הרומית שמספר תושביה הוערך במאה הב' לספירה בכ 20,000 נפש מכפילה במחצית הראשונה של המאה הו' לספירה את אוכלוסייתה. בפרק זמן זה מעידה אוכלוסיית העיר על גיוון רב ובצד קהילה נוצרית ההולכת ומתעצמת יש עדיין בעיר גרעין פאגני של נוצרים חדשים, קהילה יהודית גדולה וקהילה שומרונית, מן הגדולות שמחוץ לשומרון, ושניה רק לזו שבקיסריה, בירת הפרובינקיה הראשונה. לנכבדי העדה השומרונית כעולה מכתובות התקופה ומקורותיה (קיריליוס מסקיתופוליס) השפעה פוליטית רבה במנהל הפרובינקיה ואף בחצר הקיסר.