יסודותיה של כת האיסיים מונחים, לדעתם של חוקרים אחדים, בחבורות של 'חסידים' – חוגי יהודים חרדים לדתם ולתרבותם ומתנגדים לתרבות ההלניסטית, שנתגבשו בראשית ימי שלטונם של החשמונאים. אפשר שבחוגים אלה ראשית היווצרותה של כת האיסיים, שחבריה חרדו מפני השפעתה הגוברת של התרבות ההלניסטית הזרה והטיפו לאורחות-חיים על-פי מצוות התורה.

מקורות היסטוריים ומחקרים ארכיאולוגיים מלמדים, שהיישוב הקדום בחורבת קומרן נוסד במחצית השנייה של המאה הב' לפסה"נ, בימי שלטונו של בית חשמונאי ביהודה. פער ברצף ההתיישבות באתר זה נקשר עם רעש אדמה חזק, שפקד את האזור. האתר ניטש בימי השתלטותם של הרומאים על ארץ-ישראל, בערך בשנת 68 לסה"נ, כשנתיים קודם לנפילתו של השלטון היהודי הריבוני ביהודה ולחורבן המקדש בירושלים בשנת 70 לסה"נ.

עיקר ידיעותינו על המאורעות, שהתחוללו בפרק-זמן גורלי זה, מקורו במגילות מאזור חורבת קומרן, אולם מידע על אודות האיסיים נכלל במקורות קדומים בני הזמן ההוא – בכתביהם של יוסף בן-מתתיהו (פלאוויוס יוספוס), פילון האלכסנדרוני ופליניוס הזקן, ודבריהם של אלה הולכים ומתאשרים בממצאים מן החפירות הארכיאולוגיות בחורבת קומרן ובמחקרן של המגילות.

ההיסטוריון יוסף בן-מתתיהו מגולל את פרשת התפלגותם של היהודים בארץ-ישראל בימי הבית השני לשלושה פלגים: הצדוקים, הפרושים והאיסיים. עם הצדוקים נמנו בעיקר חוגי הכוהנים ובני המשפחות המיוחסות; הפרושים היו בני דלת העם; והאיסיים היו קבוצה מתבדלת קטנה, שמתוכה פרשה עדה סגפנית ונזירית אל המדבר. הנטיות הפוליטיות והדתיות של כל אחת מן הקבוצות הללו עודן מעורפלות למדי, כשם שאין בידינו מידע רב באשר להתפתחותן וליחסים ביניהן, ופרשה היסטורית זו היא מקור לסברות רבות ושונות בקרב החוקרים.

המשבר, שבעטיו התפלגו האיסיים ופרשו מן הזרם המרכזי של היהדות בת-זמנם, התחולל, על-פי הסברה, כשהשליטים יונתן (160-142 לפסה"נ) ושמעון (142-132 לפסה"נ) לבית חשמונאי תבעו לעצמם גם את כהונת הכהן הגדול, לחרדתם של היהודים הקנאים למצוות התורה; חלק מהם, שבעיניו היו כוונות אלה קשות מנשוא, גינה את השליטים החדשים הללו. נראה שרדיפת האיסיים ומנהיגם, 'מורה הצדק', עוררה את החזיונות של אחרית הימים, המצויים בכתבי הכת. בחזיונות הללו מתוארים הדחתו של 'הכהן הרשע' בירושלים מכהונתו וסילוק הרשעים, ועם ראשיתו של העידן – הכרת הכל בבני הכת כבני ישראל האמיתיים. בעצם פרישתם של בני הכת אל המדבר יש, לדידם, כדי "להיבדל מעדת אנשי העוול" (מגילת הסרכים ה:ב).

לוח השנה, שנהג בקרב האיסיים, היה יסוד חשוב באורח-חייהם. לוח זה היה מבוסס על שנת השמש, שבה 364 ימים – שלא כלוח השנה היהודי המקובל, שהיה מבוסס על שנת הירח, בת 354 ימים. לא ידוע כיצד הותאם לוח השנה של האיסיים למחזור השנה.

לוח השנה של בני הכת נסמך בקביעות על יום ד' בשבוע, היום שבו נבראו המאורות ברקיע. השנה, שהיתה בת חמישים ושניים שבועות, נחלקה לארבע עונות, שלושה-עשר שבועות בכל עונה. החגים והמועדים חלו לעולם באותו יום מימות השבוע. מחזור שמש כדוגמת זה היה ידוע מכבר מן הספרות הפסבדו-אפיגרפית. לוח שנה זה היה בעל חשיבות מכרעת בהיבדלותם של האיסיים מעל שאר ישראל, שכן ימות החג והצומות, שנחוגו בעדה המתבדלת, היו בשאר הקהילות ימות חולין – ולהיפך. מחברו של ספר היובלים מאשים את מי שנוהגים על-פי מחזור הירח, על שהם עושים את ימות החול – "ימות הטומאה" – ל"ימי חג ומועד" (ספר היובלים ו:לו-לז).

האיסיים התמידו באורח חיים מתבדל במשך כמאתיים שנה; הם עסקו בלימוד ובקיומם של חיי שיתוף, שכללו סדרי פולחן ועבודה. ודאי, מכל מקום, שקבוצות גדולות של חסידיה של עדה זו חיו בערים ובכפרים בארץ הנושבת, הרחק מחורבת קומרן וסביבתה.

המלה 'איסי' אינה מופיעה במפורש אף לא באחת מן המגילות. כיצד אפוא ניתן ליחס איזו מן התעודות מאזור מדבר יהודה לכת האיסיים? טיעון בזכות ייחוסם של הכתבים הקדומים לכת האיסיים נסמך על חלוקתה של היהדות בימי הבית השני לשלוש קבוצות, כמתואר בחיבורים אחדים (למשל בפשר נחום) – דהיינו ל'אפרים', ל'מנשה' ול'יהודה', באורח התואם את תיאורי ההיסטוריונים הקדומים בדבר התפלגותם של היהודים בתקופה ההיא לשלוש סיעות, צדוקים, פרושים ואיסיים. בחלק מן המגילות מכנים עצמם בני הכת כ'יהודה', ולפיכך ברור למדי עם איזה מפלגי העם הם זיהו את עצמם. יתר על כן, תפיסותיהם הדתיות ואמונותיהם, כפי שאלו משתקפות במגילות, עולות בקנה אחד עם תיאור האיסיים בכתבי ההיסטוריונים בני הזמן ההוא, והן מנוגדות בתכלית לאלו של הקבוצות האחרות בעם ישראל. מנהגים, המתוארים במקורות קדומים כמנהגי איסיים – בהם פרק-זמן של מועמדות, שחויבו בו המבקשים להצטרף לכת, טבילות טהרה תכופות וסעודות בצוותא – משתקפים היטב בחיבורים המיוחסים לבני הכת עצמם. כך, למשל, בתיאור שבסרך היחד: "ויחד יאכלו ויחד ייוועצו" (מגילת הסרכים ו:ב). ולבסוף, פליניוס הזקר מספר, שמקום מושבה של עדת האיסיים היה באזור ים המלח.

כל הסימוכין הללו מקובלים כיום על רוב החוקרים, ולפיהם מזהים את שרידי היישוב בחורבת קומרן כמרכזם של האיסיים, ואת הכתובים הקדומים, שנמצאו במערות שבקרבת האתר, כחיבורים שחיברו בני הכת. אף- על-פי-כן ישנם חוקרים, הדוחים בתוקף את הזיהוי; אלה סבורים, שהשרידים בחורבת קומרן הם שרידים של מצד, שבו ישב חיל משמר, ואחרים מבקשים לראות בשרידים אלה בית אמידים לשהיה בעונות החורף. על-פי פרשנות זו המגילות אינן אלא אוסף מלוקט ממקורות שונים, לאו דווקא מאזור ים המלח, כשם שאין הן בהכרח חיבורים של כת מתבדלת, ואולי הן אפילו שרידי של ספריית בית המקדש בירושלים. חוקרים אחרים רואים בכתובים מאזור חורבת קומרן חיבורים של קבוצות שקדמו לנוצרים, או אפילו חיבורים שנכתבו בחוגי הנוהים אחר ישו – יהודים-נוצרים, שעדיין קיימו את ההלכה היהודית.